การเก็บรักษาเชื้อบริสุทธิ์

            หลังจากการแยกเชื้อบริสุทธิ์ของจุลินทรีย์ได้แล้ว ก่อนที่จะนำไปศึกษาคุณสมบัติด้านต่างๆนั้น ต้องนำไปเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อเพิ่มปริมาณให้มากพอ และมีการเก็บรักษาให้ถูกวิธี เพื่อไม่ให้เชื้อเกิดการปนเปื้อนกับเชื้ออื่นๆ และสามารถเก็บไว้ได้นานโดยไม่สูญพันธุ์หรือกลายพันธุ์ หรือสูญเสียคุณสมบัติไป ในปัจจุบันหลายประเทศมีสถาบันเก็บรักษาเชื้อจุลินทรีย์ เพื่อบริการแก่หน่วยงานที่ต้องการนำเชื้อจุลินทรีย์ไปศึกษาวิจัย หรือปฏิบัติทางพันธุวิศวกรรม ในประเทศไทยมีหน่วยงานเก็บรักษาจุลินทรีย์ที่สถาบันวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งประเทศไทย

ภาพ การเก็บรักษาเชื้อบริสุทธิ์
ที่มา https://pixabay.com/th/

วิธีการเก็บรักษาเชื้อบริสุทธิ์มีหลายวิธี ดังนี้

1. Subculture เป็นการเก็บรักษาจุลินทรีย์ในหลอดอาหารเลี้ยงเชื้อ ซึ่งเป็นวิธีการที่ง่ายที่สุด และมักใช้ในห้องปฏิบัติการทั่วไป โดยการนำเชื้อมาเลี้ยงในหลอดอาหาร เมื่อเชื้อเจริญสูงสุดและเข้าสู่ระยะที่จะตายลง ต้องทำการถ่ายเชื้อไปสู่หลอดอาหารใหม่ ซึ่งระยะเวลาในการถ่ายเชื้อแต่ละครั้งจะแตกต่างกันไป แล้วแต่ชนิดของจุลินทรีย์ อาหารที่ใช้ และสภาพในการเก็บรักษา การเก็บหลอดเลี้ยงเชื้อในที่มีอากาศเย็น เช่น ในตู้เย็น จะทำให้เชื้อเจริญได้ช้าลง การใช้ฝาเกลียวปิดหลอดอาหารแทนการใช้จุกสำลี จะทำให้อากาศไม่ผ่านเข้าออก ทำให้อาหารเลี้ยงเชื้อแห้งช้าลง เชื้อเจริญอยู่ได้นาน นอกจากนี้การปิดทับผิวหน้าอาหารเลี้ยงเชื้อด้วยพาราฟินเหลว (Liquid parafin) เป็นการยืดอายุการเก็บเชื้อให้ยาวนานออกไปได้อีกวิธีการเก็บรักษาเชื้อโดยการถ่ายเชื้อบ่อยๆ อาจทำให้เกิดผลเสียหายหลายประการ เช่น เกิดการปนเปื้อนกับเชื้ออื่น (Contamination)
2. เก็บภายใต้พาราฟินเหลวหรือน้ำมันแร่ ทำเหมือนวิธีแรก แต่เมื่อจุลินทรีย์เจริญเต็มที่แล้วให้เทพาราฟินเหลวที่ฆ่าเชื้อแล้วทับให้ท่วมโคโลนีเชื้อ ให้ระดับพาราฟินอยู่สูงจากปลายวุ้นอาหารครึ่งนิ้ว เก็บที่อุณหภูมิห้อง หรือที่ 0-5 ^oC วิธีนี้มีข้อดีข้อเสียเหมือนวิธีแรก แต่จะเก็บได้นาน 1-2 ปี และไม่สะดวกเวลานามาใช้เนื่องจากมีน้ำมันเททับ
3. Drying เป็นการเก็บรักษาเชื้อจุลินทรีย์ในสภาพแห้ง เป็นการทำให้จุลินทรีย์มีอัตรา Metabolism ต่ำลง วิธีนี้ไม่ค่อยนิยมใช้ เพราะจุลินทรีย์บางชนิดเก็บรักษาโดยวิธีนี้จะไม่ได้ผล เพราะจะตายในสภาพแห้งและขาดน้ำ วิธีนี้จะใช้กับจุลินทรีย์ที่ไม่สามารถทนทานต่อสภาพเย็นจัดได้ และใช้กับจุลินทรีย์ที่มีสปอร์
4. Freezing เป็นการเก็บรักษาจุลินทรีย์ในสภาพเย็นจัด ใช้ได้กับจุลินทรีย์เกือบทุกชนิด และมีอายุการเก็บรักษายาวนาน วิธีการ คือ เพาะเลี้ยงจุลินทรีย์บนอาหารวุ้นจนเชื้อเจริญดีแล้วก็ผสมสารป้องกันไม่ให้เซลล์ถูกทำลาย (Cryoprotective agent) ในขณะแช่แข็ง เช่น glycerol หรือ dimethyl sulphoxide ผสมให้เข้ากันดี แล้วถ่ายใส่หลอดขนาดเล็กปิดฝาให้แน่น ใส่ในเครื่องลดอุณหภูมิ แล้วนำไปเก็บในถังบรรจุไนโตรเจนเหลวที่อุณหภูมิ –196 องศาเซลเซียส วิธีการนี้จะเก็บรักษาจุลินทรีย์ได้นาน ซึ่งวิธีการนี้สามารถเก็บได้นานถึง 30 ปี วิธีการนี้ใช้ได้กับจุลินทรีย์เกือบทุกชนิด อายุการเก็บนานกว่าวิธีอื่น แต่ข้อเสีย คือ เครื่องมือและหลอดเก็บราคาสูง สิ้นเปลืองไนโตรเจนเพราะระเหยตลอดเวลา

5. Lyophillization หรือ Freeze-drying เป็นวิธีการเก็บรักษาจุลินทรีย์ในสภาพที่มีอุณหภูมิต่ำมากๆ ในชั่วระยะเวลาหนึ่ง จะทำให้กิจกรรมของจุลินทรีย์หยุดชะงักเป็นวิธีการที่นิยมในห้องปฏิบัติการขนาดใหญ่ และมีเชื้อบริสุทธิ์จำนวนมาก วิธีการเก็บรักษาทำโดยเลี้ยงจุลินทรีย์บนอาหารวุ้น จนเชื้อเจริญดีจึงผสมของเหลว เช่น horse serum ลงไป แล้วถ่ายเชื้อลงในหลอดแก้ว นำไปเข้าเครื่อง lyophillizer ซึ่งทำให้เชื้ออยู่ในสภาพเย็นจัดและแข็งตัวในสภาพสุญญากาศ วิธีการนี้ทำให้จุลินทรีย์คงสภาพรูปร่างและมีชีวิตอยู่ได้นานเป็นสิบปี

            การเก็บรักษาจุลินทรีย์แต่ละชนิดมีวิธีการที่แตกต่างกันไป ขึ้นอยู่กับชนิด จำนวนของจุลินทรีย์ และความเหมาะสมในการปฏิบัติงาน นอกจากนี้ยังมีวิธีการอื่นๆ อีก เช่น การเก็บรักษาแบคทีเรียบนอาหารวุ้นภายใต้พาราฟีนเหลว ซึ่งเป็นวิธีการที่ไม่ยุ่งยาก และยังสามารถเก็บรักษาจุลินทรีย์ได้นาน ยีสต์สามารถเก็บรักษาโดยการทำให้แห้งบนกระดาษกรอง เชื้อราบางชนิด เช่น Aspergillus sp., Penicillium sp. สามารถเก็บรักษาได้หลายวิธี แต่มีวิธีหนึ่งที่นิยมและเก็บรักษาได้ดี คือ การเก็บรักษาในดิน ซึ่งสามารถเก็บรักษาได้นานถึง 10 ปี และเชื้อรายังคงมีสภาพทางพันธุกรรมไม่เปลี่ยนแปลง

            วิธีการรักษาเชื้อจุลินทรีย์ที่ยกตัวอย่างมานี้ ทุกวิธีมีกระบวนการมีขั้นตอนที่จะต้องปฏิบัติสรุปได้ดังนี้ คือ

1. การทดสอบความบริสุทธิ์ และคุณสมบัติเฉพาะของเชื้อที่ต้องการจะเก็บ โดยต้องทราบข้อมูลเกี่ยวกับจุลินทรีย์ที่ต้องการเก็บ คุณสมบัติเฉพาะของจุลินทรีย์ที่จะเก็บรักษา อาหาร, อุณหภูมิและ เวลาที่เหมาะสม ที่ใช้ในการบ่มเชื้อ และบันทึกไว้
2. การเตรียมหลอดสำหรับการจัดเก็บเชื้อ หลอดแก้วเก็บเชื้อ (Ampoules) ที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว มีการติดป้ายชื่อรหัสให้เรียบร้อยเพื่อป้องกันการสับสน
3. การเลี้ยงเชื้อ จุลินทรีย์ให้เจริญ พร้อมใช้งาน รอรับการถ่าย
4. เตรียมเชื้อให้อยู่ในรูปสารละลาย (Suspension Cell) ในอาหารเก็บเชื้อ สารละลายที่เหมาะสม
5. เก็บรักษาเชื้อ จุลินทรีย์ ในหลอดแก้วเก็บเชื้อ (Ampoules) เหล่านี้ตามวิธีที่กำหนด วิธีที่เลือกซึ่งเหมาะกับห้องปฏิบัติการของตน
6. จัดทำบันทึก หลักฐาน ข้อมูลต่างๆ วันที่จัดเก็บ จำนวนหลอดที่จัดเก็บ
7. เมื่อจะนำเชื้อ จากหลอดมาใช้งาน ต้องตรวจสอบ คุณภาพของเชื้อ คือ ทดสอบการมีชีวิตรอด คุณสมบัติทางพันธุกรรม และคุณสมบัติเฉพาะของเชื้อ นั้น ๆ ซึ่งต้องถูกต้องตรงกันก่อนนำไปใช้งานจริง

            จุดประสงค์การเก็บรักษาเชื้อจุลินทรีย์อ้างอิง คือ การรักษาจุลินทรีย์ ที่เป็นเชื้อบริสุทธิ์ ไว้ในสภาพที่มีชีวิตอยู่ มีคุณสมบัติเหมือนเดิม ไม่มีเกิดการปนเปื้อนเพื่อ

• ใช้งานประจำ (Working Culture)
• การควบคุมคุณภาพของผลิตภัณฑ์
• เก็บไว้เพื่อเป็นเชื้ออ้างอิง (Reference Culture) ในการตรวจสอบความถูกต้องวิธี วิเคราะห์ทดสอบ ควบคุมคุณภาพทางจุลชีววิทยา ซึ่งเป็นสิ่งสำคัญที่จะเพิ่มความเชื่อมั่นในผลการทดสอบ