เทคโนโลยีดีเอ็นเอ  

เทคโนโลยีดีเอ็นเอ เป็นเทคนิคทางอณูพันธุศาสตร์ที่กำลังมีบทบาทสำคัญในการเกษตร โดยเฉพาะในงานปรับปรุงพันธุ์พืช ซึ่งถือว่าเป็นหัวใจสำคัญในการสร้างพืชพันธุ์ใหม่ ให้มีลักษณะดีตรงตามความต้องการของตลาด และมีผลผลิตสูงเป็นที่ต้องการของผู้ปลูก กระบวนการปรับปรุงพันธุ์พืช เป็นงานที่รวมทั้งศาสตร์และศิลป์เข้าด้วยกัน โดยอาศัยความพยายามของ นักปรับปรุงพันธุ์พืช ที่จะรวบรวมลักษณะทางพันธุกรรมที่ดีเด่นจากแหล่งต่าง ๆ มา สร้างพืชพันธุ์ใหม่ โดยใช้กระบวนการ คัดเลือกและปรับปรุงพันธุ์ที่เหมาะสม งานปรับปรุงพันธุ์พืช จึงมีความจำเป็นต้องใช้เครื่องมือที่มีความแม่นยำในการคัดเลือกและแยกความแตกต่างของลักษณะที่แสดงออกของแต่ละสายพันธุ์ ดังนั้นเครื่องหมายดีเอ็นเอ จึงเข้ามามีบทบาทมากขึ้น เพราะเป็นการคัดเลือกพืชจากจีโนไทป์โดยตรง

เครื่องหมายทางพันธุกรรม หมายถึง ลักษณะหรือตัวบ่งชี้ที่มีความเฉพาะเจาะจง สามารถนำมาใช้แยกความแตกต่างทาง พันธุกรรม และสามารถถ่ายทอดลักษณะนั้นๆไปยังรุ่นลูกได้ เครื่องหมายทางพันธุกรรมที่มีการใช้กันมานานแล้วในงานปรับปรุงพันธุ์พืช ได้แก่ การใช้ลักษณะรูปพรรณสัณฐานพืชที่มีความแตกต่างกันมาใช้เป็นเครื่องหมาย เช่น ความสูง ลักษณะทรงพุ่ม สีของลำต้น ขนาด รูปร่างและสีของเมล็ด อายุวันออกดอก และวันเก็บเกี่ยว เป็นต้น โดยเรียกเครื่องหมายบ่งชี้นี้ว่า

“เครื่องหมายทางสัณฐานวิทยา” (morphological markers)อย่างไรก็ตาม พบว่าลักษณะดังกล่าวมักผันแปรไปตามสภาพ แวดล้อมที่เปลี่ยนแปลงไป ทำให้เกิดความผิดพลาดในการแยกความแตกต่างของ สายพันธุ์ได้ นอกจากนั้นแล้ว การเปรียบเทียบลักษณะภายนอกนี้ ยังไม่สามารถแยกความแตกต่างของสายพันธุ์พืชบางชนิด ที่มีความ

ใกล้ชิดทางพันธุกรรมได้ ดังนั้น จึงจำเป็นต้องหาเครื่องบ่งชี้ชนิดอื่นมาประกอบ เพื่อช่วยให้การจำแนกความแตกต่างของ สายพันธุ์มีความถูกต้อง ต่อมาได้มีการพัฒนาเครื่องหมายโปรตีน

(protein marker)เช่น ไอโซไซม์(isozyme)เข้ามาช่วยในการบ่งชี้ความแตกต่างของสายพันธุ์พืช(varietal identification)โดยใช้ความแตกต่างของโมเลกุลโปรตีนที่เป็นองค์ประกอบของพืชมาตรวจสอบ ตัวอย่างเช่น การตรวจสอบรูปแบบขององค์ประกอบโปรตีนของเอนไซม์บางชนิดและโปรตีนที่สะสมในเมล็ดพืช เครื่องหมายโปรตีนถูกนำมาใช้อย่างแพร่หลายในการตรวจสอบความบริสุทธิ์ของสายพันธุ์พืชในธุรกิจเมล็ดพันธุ์ เนื่องจากค่าใชจ่ายไม่สูงมากนัก อย่างไรก็ตาม เครื่องหมายโปรตีนยังมีข้อจำกัดที่สำคัญ คือ จำนวนยีนที่ใช้ตรวจสอบยังมีไม่มากนัก และยีนที่นำมาศึกษาต้องมีการแสดงออก(gene expression)ด้วย การตรวจสอบจึงจำเป็นต้องเลือกเนื้อเยื่อพืชและระยะการเจริญเติบโตที่เหมาะสม โดยคำนึงถึงการแสดงออกของยีนที่ต้องการตรวจสอบ นอกจากนั้น ผลการตรวจสอบยังขึ้นอยู่กับสภาพแวดล้อมอีกด้วย ทำให้โอกาสการตรวจพบความแตกต่างในระดับโปรตีนมีค่าต่ำกว่าที่เป็นจริง จากข้อจำกัดดังกล่าว ทำให้นัก-วิทยาศาสตร์พยายามค้นหาและพัฒนาเทคนิคใหม่ๆมาใช้เป็นเครื่องหมายบ่งบอกภาพมากกว่าเครื่องหมายพันธุกรรมดังกล่าว ประกอบกับความก้าวหน้าทางด้านเทคโนโลยีดีเอ็นเอที่มีการพัฒนาอย่างรวดเร็วและต่อเนื่องในช่วง20ปีที่ผ่านมา ได้เปิดเผยความลี้ลับของรหัสพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิต และมีการศึกษาวิจัยและพัฒนาเครื่องหมายโมเลกุลที่ใช้ บ่งบอกความแตกต่างของสิ่งมีชีวิตในระดับสารพันธุกรรม(genetic material)หรือ ดีเอ็นเอ ได้อย่างมีประสิทธิภาพความแตกต่างของสายพันธุ์พืชที่มีประสิทธิ

เครื่องหมายดีเอ็นเอ(DNA Markers)หมายถึง ลำดับเบสช่วงหนึ่งของดีเอ็นเอที่ใช้เป็นเครื่องหมายบ่งชี้ความเป็นเอกลักษณ์ของสิ่งมีชีวิต โดยอาจมีตำแหน่งบนโครโมโซม ในนิวเคลียส(nuclear DNA)หรือใน ออร์แกเนลล์(mitochondria DNAหรือchloroplast DNA)และสามารถถ่ายทอดไปยังรุ่นลูกได้ พืชแต่ละชนิดแต่ละสายพันธุ์ มีการจัดเรียงตัวของนิวคลีโอไทด์ในโมเลกุลของดีเอ็นเอที่เป็นเอกลักษณ์ ความแตกต่างหรือโพลีมอร์ฟิซึมการใช้ดีเอ็นเอเป็นเครื่องหมายในการบ่งบอกความแตกต่างของสิ่งมีชีวิต สามารถทำได้โดยการเปรียบเทียบลักษณะของดีเอ็นเอของสิ่งมีชีวิตนั้นๆ โดยเทคนิคทางอณูวิทยา ซึ่งเป็นที่รู้จักกันโดยทั่วไปว่า(polymorphisms)ของลำดับเบสในโมเลกุลของดีเอ็นเอนี่เอง ที่ทำให้สิ่งมีชีวิตมีความแตกต่างกัน และสามารถนำมาประยุกต์ใช้เป็นเครื่องหมายโมเลกุลได้“ลายพิมพ์ดีเอ็นเอ” (DNA Fingerprinting)ซึ่งความแตกต่างที่เกิดขึ้น หมายถึง แบบแผนดีเอ็นเอที่จำเพาะของสิ่งมีชีวิตหนึ่งๆ นั่นเอง สามารถนำมาตรวจสอบความแตก-ต่างหรือโพลีมอร์ฟิซึมของสิ่งมีชีวิตหรือสายพันธุ์พืชที่ต้องการตรวจสอบได้

ประเภทของเครื่องหมายดีเอ็นเอ

เครื่องหมายดีเอ็นเอ สามารถแบ่งออกเป็นประเภทใหญ่ๆ ได้

1. Hybridization-based marker

2ประเภท คือเป็นเครื่องหมายดีเอ็นเอ ซึ่งพัฒนาขึ้นโดยอาศัยหลักการเข้าคู่ของลำดับเบสดีเอ็นเอที่เป็นคู่สมกันระหว่างดีเอ็นเอตรวจสอบ(probe)กับดีเอ็นเอที่ต้องการตรวจสอบ โดยใช้เทคนิคไฮบริไดเซชัน(hybridization)ตัวอย่างได้แก่ เครื่องหมายอาร์เอฟแอลพี

(RFLP marker )

เทคนิคพีซีอาร์เป็นเทคนิคการเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอในหลอดทดลอง ค้นพบโดย Kary Mullis ในปี ค.ศ. 1980 เทคนิคนี้เป็นการจำลองดีเอ็นเอในสิ่งมีชีวิต โดยอาศัยเอนไซม์ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่ทนต่ออุณหภูมิสูงและสามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอที่ต้องการเป็นจำนวนมาก ภายในเวลาเพียง 2 – 3 ชั่วโมง เทคนิคพีซีอาร์มี 3 ขั้นตอน คือ ขั้นตอนการแยกดีเอ็นเอเป็นสายเดี่ยว (denaturation) เป็นขั้นตอนที่ดีเอ็นเอต้นแบบถูกทำให้แยกออกจากกันเป็นสายเดี่ยว 2 สาย เพื่อเปิดโอกาสให้ไพรเมอร์เข้าไปจับกับบริเวณที่ต้องการเพิ่มปริมาณบนสายดีเอ็นเอต้นแบบ ขั้นตอนการจับของไพรเมอร์กับดีเอ็นเอต้นแบบ (annealing) เป็นขั้นตอนที่ไพรเมอร์ซึ่งเป็นดีเอ็นเอสายเดี่ยวท่อนสั้นๆ จะเข้าจับกับบริเวณที่เป็นคู่สมกับดีเอ็นเอต้นแบบ และขั้นตอนการสร้างดีเอ็นเอสายใหม่ (extension) เป็นขั้นตอนที่เอนไซม์ดีเอ็นเอโพลีเมอเรสเติมนิวคลีโอไทด์ทั้ง 4 ชนิดเข้าที่ปลาย 3´ของไพรเมอร์ โดยมีลำดับการเรียงตัวของนิวคลีโอไทด์ตามเบสที่เป็นคู่สมกับดีเอ็นเอต้นแบบ สายดีเอ็นเอที่ได้จะยาวขึ้น ปฏิกิริยาทั้ง 3 ขั้นตอนจะดำเนินไปตามโปรแกรมจำนวนรอบของอุณหภูมิที่ตั้งค่าไว้ ซึ่งเทคนิคพีซีอาร์ทำให้เกิดเทคนิคใหม่ๆ ทางพันธุศาสตร์โมเลกุล ในการวิเคราะห์จีโนม (ปรีชาประเทพา. 2543 : 45 – 50) เช่น เทคนิคอาร์เอพีดี (RAPD : random amplified polymorphic DNA) เทคนิคเอเอฟแอลพี (AFLP : amplified fragment length polymorphism) เทคนิคเอ็มพี พีซีอาร์ (MP – PCR : microsatellite – primed PCR) เทคนิคไอเอสเอสอาร์ (ISSR : inter simple sequence repeat) เทคนิคเอสอาร์เอพี (SRAP : sequence – related amplified polymorphism) เทคนิคทีอาร์เอพี (TRAP : target region amplification polymorphism) เทคนิคเอสซีเออาร์ (SCAR : sequence characterized amplified region)