กล้องจุลทรรศน์: แบบใช้แสงอิเล็กตรอน

        กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนเป็นเครื่องมือที่พัฒนามาจากกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงธรรมดา เหตุผลที่ทำให้ประดิษฐ์เครื่องมือนี้ขึ้นมาเนื่องจากว่า ประสิทธิภาพในการขยายภาพของกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงแบบธรรมดานั้นไม่สามารถศึกษารายละเอียดของโครงสร้างภายในของสิ่งมีชีวิตและสิ่งที่มีขนาดเล็กมากๆอย่างเช่น ดีเอ็นเอ (Deoxyribo nucleic acid : DNA) ก็ไม่สามารถมองเห็นได้ และเครื่องมีนี้ได้ประดิษฐ์ขึ้นครั้งแรกในประเทศเยอรมนี ในปีค.ศ.1932 โดยนักวิทยาศาสตร์ 2 ท่าน คือ Max Knoll และ Ernst Ruska ซึ่งแสงที่ใช้เป็นลำแสงอิเล็กตรอน ที่มีขนาดของความยาวคลื่นประมาณ 0.025 อังสตรอม (^oA) มีกำลังขยายถึง 500,000 เท่า หรือมากกว่าแหล่งกำเนิดแสงอิเล็กตรอนได้จากปืนยิงอิเล็กตรอน (Electron gun) ซึ่งเป็นขดลวดทังสเตน มีลักษณะเป็นรูปตัววี เมื่อขดลวดทังสเตนรั้นขึ้นโดยการเพิ่มกระแสไฟฟ้าเข้าไปในขดลวด ทำให้อิเล็กตรอนถูกปลดปล่อยออกมาจากขดลวดทังสเตน เนื่องจากอิเล็กตรอนมีขนาดเล็กมาก และเพื่อเป็นการป้องกันการชนกันของมวลอากาศกับลำแสงอิเล็กตรอน ซึ่งจะทำให้เกิดการหักเหได้ จึงต้องมีการดูดอากาศจากตัวกล้องให้เป็นสุญญากาศระบบเลนส์ที่ใช้เป็นระบบเลนส์แม่เหล็กไฟฟ้า (Electromagnetic lens) แทนเลนส์แก้วในกล้องจุลทรรศน์ชนิดแสงธรรมดา เลนส์แม่เหล็กไฟฟ้าประกอบด้วยขดลวดพันรอบแท่งเหล็ก เมื่อกระแสไฟฟ้าผ่านเข้าไปทำให้เกิดสนามแม่เหล็กขึ้น สนามแม่เหล็กไฟฟ้าจะทำให้ลำแสงอิเล็กตรอนเข้มขึ้น เพื่อไปตกกระทบกับตัวอย่างวัตถุที่จะศึกษา เลนส์ของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนประกอบด้วยเลนส์รวมแสง (Objective lens) และ Projector Lens โดยที่ Projector lens ทำหน้าที่ฉายภาพจากวัตถุ Electron Microscope ตัวอย่างที่จะศึกษาลงบนจอภาพคล้ายกับ Eyepiece ของกล้องจุลทรรศน์ชนิดแสงธรรมดา จอภาพฉาบด้วยสารเรืองแสงพวกฟอสฟอรัส เมื่อลำแสงอิเล็กตรอนตกลงบนจอ จะทำให้เกิดการเรืองแสงขึ้นซึ่งเป็นสารสีเขียวแกมเหลืองที่มองได้ด้วยตาเปล่า

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนในปัจจุบันมี 2 ชนิดด้วยกัน

1. กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนชนิดส่องผ่าน (Transmission Electron Microscope: TEM)

เอิร์นสต์ รุสกา สร้างสำเร็จเป็นคนแรก ในปี ค.ศ.1932 ใช้ในการศึกษาโครงสร้างภายในของเซลล์โดยลำแสงอิเล็กตรอนจะส่องผ่านเซลล์ หรือวัตถุตัวอย่างที่ศึกษา ซึ่งต้องมีลักษณะบางเป็นพิเศษ ขั้นตอนในการเตรียมตัวอย่างที่ศึกษายุ่งยาก

หลักการทำงานของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนชนิดส่องผ่าน

1. กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน หรือ TEM จะใช้ลำอิเล็กตรอนจากแหล่งกำเนิดอิเล็กตรอน ส่องไปยังวัตถุ แทนที่จะใช้แสงส่องผ่านวัตถุแบบกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง ซึ่งลำอิเล็กตรอนจะมีความยาวคลื่นสั้นกว่าแสง ทำให้สามารถขยายภาพของวัตถุได้มากกว่า
2. เมื่อลำอิเล็กตรอนพุ่งออกมาจากแหล่งกำเนิด จะผ่านสนามแม่เหล็กไฟฟ้า ซึ่งทำหน้าที่หักเหลำอิเล็กตรอนแทนเลนส์ จึงเรียกสนามแม่เหล็กไฟฟ้านี้ว่า electromagnetic lens
3. ลำอิเล็กตรอนจะส่องผ่าน condenser lens ซึ่งเป็นสนามแม่เหล็กไฟฟ้าที่ทำหน้าที่หักเหลำอิเล็กตรอนหรือ electromagnetic lens เช่นเดียวกับเลนส์ชุดแรก เพื่อโฟกัสลำอิเล็กตรอนให้ตกลงบนวัตถุ
4. เมื่อส่องผ่านวัตถุ สนามแม่เหล็กไฟฟ้า หรือ electromagnetic lens อีกชุดหนึ่ง จะทำหน้าที่เหมือน objective lens หักเหลำอิเล็กตรอน ให้เกิดการขยายและโฟกัสภาพวัตถุที่ส่องผ่าน แล้วจะมี projection lens ทำหน้าที่โฟกัสลำอิเล็กตรอนอีกครั้งหนึ่ง
5. ภาพของวัตถุจะตกลงบนจอภาพเรืองแสงหรือจอฟลูออเรสเซนซ์ ถ้าต้องการภาพถ่ายจะใช้แผ่นฟิล์มบันทึก และนำไปล้างและอัดเป็นภาพ หรืออาจบันทึกภาพด้วยอุปกรณ์รับภาพแบบ CCD หรือ charge-coupled device ได้เป็นภาพอิเล็กทรอนิกส์ในคอมพิวเตอร์
6. กล้องจุลทรรศน์ชนิดส่องกราด (Scanning Electron Microscope: SEM)

        เอ็ม วอน เอนเดนนี (M Von Andenne) สร้างเสร็จในปี ค.ศ. 1938 โดยใช้ศึกษาผิวของเซลล์หรือผิวของตัวอย่างวัตถุที่นามาศึกษา โดยลำแสงอิเล็กตรอนจะส่องกราดไปบนผิวของวัตถุ

หลักการทำงานของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนชนิดส่องกราด

         เกิดจากการที่ Primary electron วิ่งไปกระทบพื้นผิวของวัตถุ   ทำให้มีการสะท้อนกลับของพลังงานในรูปแบบต่างๆ เช่น back-scatter electron, รังสีเอ็กซ์ (X-ray) หรือ secondary electron เป็นต้น และในลำกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนชนิดส่องกราด จะมีตัวรับสัญญาณที่ทำหน้าที่รับและเปลี่ยน secondary electron ให้เป็นสัญญาณอิเล็กตรอน (electrical signal) แล้วส่งสัญญาณไปยังจอภาพ (Cathode ray tube) เพื่อทำให้เกิดภาพที่ตามองเห็นได้ โดยภาพที่ออกมานั้นจะมีลักษณะ 3 มิติ จากนั้นจะบันทึกภาพลง Photographic

ข้อควรระวังในการใช้กล้องจุลทรรศน์

       เนื่องจากกล้องจุลทรรศน์เป็นอุปกรณ์ที่มีราคาค่อนข้างสูงและมีส่วนประกอบที่อาจเสียหายง่ายโดยเฉพาะเลนส์ จึงต้องใช้และเก็บรักษาด้วยความระมัดระวังให้ถูกวิธี ซึ่งมีวิธีปฏิบัติดังนี้

1. ในการยกกล้องและเคลื่อนย้ายกล้อง ต้องใช้มือหนึ่งจับที่แขนและอีกมือหนึ่งรองที่ฐานของ กล้อง
2. สไลด์และกระจกปิดสไลด์ที่ใช้ต้องไม่เปียก เพราะอาจจะทำให้แท่นวางวัตถุเกิดสนิม และเลนส์ใกล้วัตถุอาจขึ้นราได้
3. เมื่อต้องการหมุนปุ่มปรับภาพหยาบต้องมองด้านข้างตามแนวระดับแท่นวางวัตถุ เพื่อป้องกันการกระทบของเลนส์ใกล้วัตถุกับกระจกสไลด์ ซึ่งอาจทำให้เลนส์แตกได้
4. การหาภาพต้องเริ่มด้วยเลนส์ใกล้วัตถุที่มีกาลังขยายต่ำสุดก่อนเสมอ
5. เมื่อต้องการปรับภาพให้ชัดขึ้นให้หมุนเฉพาะปุ่มปรับภาพละเอียดเท่านั้น เพราะถ้าหมุนปุ่มปรับภาพหยาบจะทำให้ระยะภาพหรือจุดโฟกัสของภาพเปลี่ยนไปจากเดิม
6. ห้ามใช้มือแตะเลนส์ ควรใช้กระดาษเช็ดเลนส์ในการทำความสะอาดเลนส์
7. เมื่อใช้เสร็จแล้วต้องเอาวัตถุที่ศึกษาออก เช็ดแท่นวางวัตถุและเช็ดเลนส์ให้สะอาด หมุนเลนส์ใกล้วัตถุกำลังขยายต่ำสุดให้อยู่ตรงกลางลำกล้อง และเลื่อนลำกล้องลงต่ำสุด ปรับกระจกให้อยู่ในแนวตั้งฉากกับแท่นวางวัตถุเพื่อป้องกันไม่ให้ฝุ่นเกาะ แล้วเก็บใส่กล่องหรือตู้ให้เรียบร้อย

https://pccpcell.wordpress.com

แหล่งที่มา

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน.สืบค้นเมื่อวันที่ 16 สิงหาคม 2560.จาก
       https://sites.google.com/site/aomsupaporn2535/hnwy-thi2/hnwy-thi2-2

กล้องจุลทรรศน์ - SMD : E- Learning.สืบค้นเมื่อวันที่ 16 สิงหาคม 2560.จาก
       www.learning.smd.kku.ac.th/home/images/documents/Microscope.pdf

คู่มือสื่อการสอนวิชาชีววิทยา โดยความร่วมมือระหว่าง สำนักงานคณะกรรมการการศึกษาขั้นพื้นฐาน และ คณะวิทยาศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย.สืบค้นเมื่อวันที่ 23 สิงหาคม 2560.จาก
        www.phukhieo.ac.th.pdf

บทปฏิบัติการที่ 1 กล้องจุลทรรศน์ เซลล์ และองค์ประกอบของเซลล์.สืบค้นเมื่อวันที่ 16 สิงหาคม 2560.จาก
        www.biology.sc.chula.ac.th/2303106/2303106BU/บทปฏิบัติการที่%201.pdf

นงลักษณ์ สุวรรณพินิจ, และปรีชา สุวรรณพินิจ. (2554). จุลชีววิทยาทั่วไป. กรุงเทพฯ:
        โรงพิมพ์แห่งจุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย.

การเตรียมวัสดุเพื่อศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์

          การเตรียมตัวอย่างเชื้อจุลินทรีย์เพื่อนำมาศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์ที่ใช้แสงธรรมดาอาจกระทำได้ 2 วิธี คือ เลี้ยงจุลินทรีย์ในสภาพของเหลวเพื่อทำสไลด์สดหรือหยดแขวน และอีกวิธีหนึ่งโดยการทำให้เซลล์แห้งตรึงติดอยู่กับที่ และย้อมสีเพื่อให้เห็นความแตกต่างได้

เทคนิคการเตรียมสไลด์สดและการทำหยดแขวน

การเตรียมสไลด์สด

            โดยหยดของเหลวที่มีจุลินทรีย์บนแผ่นแก้วสไลด์ ปิดทับด้วยกระจกสไลด์ โดยค่อยๆ วางกระจกปิดให้ด้านหนึ่งสัมผัสกับหยดของเหลว แล้วค่อยๆ ปล่อยกระจกปิดลงช้าๆ เพื่อไม่ให้เกิดฟองอากาศขึ้น เช็ดขอบกระจกปิดสไลด์ให้แห้ง ถ้าต้องการให้ลดการระเหยของของเหลว อาจใช้ยาทาเล็บทาปิดระหว่างขอบกระจกปิดและสไลด์

การทำหยดแขวน

            มีลักษณะคล้ายกับการทำสไลด์สด แต่ให้หยดซัสเพนชันของจุลินทรีย์บนกระจกปิดสไลด์ก่อน แล้วจึงคว่ำสไลด์หลุมตรงกลาง (depression slide) ลงบนกระจกปิด กะปริมาณให้บริเวณหลุมอยู่เหนือหยดของเหลว แล้วรีบพลิกสไลด์ให้หงายขึ้นโดยเร็ว หลดเชื้อจะแขวนอยู่กับกระจกปิดสไลด์และอยู่เหนือหลุมของสไลด์หลุมพอดี

            ข้อดีของการศึกษาด้วยสไลด์สดและการทำหยดแขวน

1. สามารถศึกษาเซลล์ที่มีชีวิตได้
2. สังเกตเห็นรูปร่างและการเรียงตัวของเซลล์ได้ชัดเจน
3. สามารถศึกษาพฤติกรรมต่างๆของเซลล์ได้ เช่น การเคลื่อนที่ด้วยแฟลกเจลลา ศึกษากิจกรรมต่างๆ ของเซลล์ เช่น การสร้างสปอร์ การแบ่งเซลล์ เป็นต้น
4. สามารถศึกษาถึงองค์ประกอบต่างๆ ภายในเซลล์ เช่น หยดไขมัน แวคิวโอล

การย้อมสี

            เนื่องจากจุลินทรีย์ซึ่งมีขนาดเล็กมากนั้นมักโปร่งแสง จึงแยกความแตกต่างกับของเหลวที่จุลินทรีย์แขวนลอยอยู่ได้น้อย ทำให้มองให้ได้ยาก ดังนั้นการย้อมสีจะช่วยให้เห็นรายละเอียดและความแตกต่างของจุลินทรีย์แต่ละชนิดได้มากขึ้น

            สีที่ใช้ในการย้อมสีแบคทีเรียนั้นเป็นสีที่อยู่ในรูปของเกลือ ซึ่งจะประกอบไปด้วยออนบวกและลบ ส่วนที่แสดงสี หรือ Chromophoric group ซึ่งเป็นส่วนที่มีประจุเป็นออนบวกหรือลบนี้ สามารถใช้ในแบ่งออกเป็น 3 ชนิดตามประจุไฟฟ้า คือ

1. Acidic dye ได้แก่ สีที่มีอนุภาคเม็ดสีเป็นประจุลบ (-) เช่นสี Eosin Y, Indian ink, Nigrosin ใช้ย้อม Cytoplasm
2. Basic หรือ Basicdic dye ได้แก่ สีที่มีอนุภาคเม็ดสีเป็นประจุ (+) เป็นสีที่ใช้กันเป็นส่วนใหญ่ เช่น Methylene blue, Crystal violet, Safranin O, Carbol fuchsin ใช้ย้อมนิวเคลียสและโครมาติน
3. Netral dye ได้แก่ สีที่อนุภาคเม็ดสีไม่มีประจุ เช่นสี Sudan III

หลักการของการติดสีในการย้อมสีแบคทีเรีย

หลักการของการติดสีในการย้อมสีแบคทีเรีย

จุรีย์รัตน์ สีสมิทธ์. ปฏิบัติการจุลชีววิทยาทั่วไป. หน้า 27.

กลไกในการติดสีย้อมของเซลล์แบคทีเรีย

            การย้อมสีเป็นปฏิกิริยาการแลกเปลี่ยนไอออนของเซลล์กับของสี กล่าวคือ ไอออนของสีจะเข้าไปแทนที่ไอออนบนส่วนประกอบของเซลล์ จึงเกิดสารประกอบของเกลือออกมาและสีจะติดที่เซลล์แทนนอกจากนี้องค์ประกอบทางเคมีของกรดนิวคลีอิคยังมีส่วนในการเกิดเกลืออีกด้วย เช่น เกลือของโซเดียมหรือโปตัสเซียม เป็นต้น เนื่องจากเซลล์ของแบคทีเรียมีประจุไฟฟ้าลบ ดังนั­นจึงดึงดูดได้ดีกับไอออนที่มีประจุไฟฟ้าบวกเช่น ถ้ามี Na⁺ หรือ K⁺ จะเกิดการดึงดูด Na⁺ หรือ K⁺ ไปติดที่เซลล์ ของแบคทีเรียเป็น (Bacterial cell)^- Na⁺ หรือ (Bacterial cell)^- K⁺

            เนื่องจากสีที่ใช้ย้อมสีแบคทีเรียอยู่ในรูปของเกลือ ซึ่งมีทั้งประจุลบและบวกด้วยกันเม่ือย้อมเซลล์แบคทีเรียทำให้เกิดการแลกเปลี่ยนประจุระหว่างสีและเซลล์ เช่น ใช้ Methylene blue chloride (MB⁺Cl^-) ย้อมเซลล์แบคทีเรีย จะเกิดการเปลี่ยนประจุกันขึ้นทำให้เซลล์ติดสีย้อมของ Methylene blue ดังสมการ

(Bacterial cell^- Na⁺) + (MB⁺Cl^-) → (Bacterial cell^- MB⁺) + (Na⁺Cl^-)

วิธีการย้อมสีแบคทีเรีย

วิธีการย้อมสีแบคทีเรียที่สำคัญมีดังนี้

1. Simple stain เป็นการย้อมสีแบคทีเรียด้วยสีย้อมชนิดเดียว เซลล์จะติดสีย้อมสม่ำเสมอทั้งหมด การย้อมสีวิธีนี้ต้องการศึกษารูปร่าง ขนาดและการจัดเรียงตัวของแบคทีเรีย ส่วนสีที่ใช้ ได้แก่ Crystal violet, Methylene blue และ Carbol fuchsin เป็นต้น
2. Differential stain เป็นการย้อมสีที่ใช้ย้อมมากกว่าหนึ่งชนิด สีจะติดส่วนต่าง ๆ ของเซลล์ทำให้เห็นความแตกต่างระหว่างเซลล์แบคทีเรียชนิดต่าง ๆ ได้ วิธีการย้อมสีแบบนี้­มีหลายวิธีที่สำคัญ คือ การย้อมสีแบบกรัม (Gram staining) และ Acid - fast stain

ตาราง แสดงปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นจากการย้อมสีแบบแกรม      

สรุปหลักเกณฑ์สำคัญในการย้อมสีแกรมได้ดังนี้

1. เซลล์ปกติของแบคทีเรียเท่านั้นที่มีการติดสีแกรมบวกและแกรมลบ แต่ถ้าทำให้เซลล์แตกจะติดเฉพาะสีแกรมลบเท่านั้น
2. การย้อมสีแกรมต้องใช้ Crystal violet และสารละลายไอโอดีนเสมอ
3. แบคทีเรียเท่านั้นที่ให้ผลแตกต่างกันในการย้อมสีแกรม แต่จุลินทรีย์ชนิดอื่น ๆ จะติดสีย้อมอย่างใดอย่างหนึ่งเท่านั้น เช่น เซลล์ของยีสต์จะติดสีแกรมบวก
4. ไซโตพลาสซึมติดสีแกรมลบเท่านั้น
5. การย้อมสีแกรม สามารถเปลี่ยนแบคทีเรียแกรมบวกเป็นแบคทีเรียแกรมลบได้ แต่ไม่สามารถเปลี่ยนแบคทีเรียแกรมลบเป็นแกรมบวกได้
6. แบคทีเรียแกรมบวกถูกล้างสีได้ยากกว่าแบคทีเรียแกรมลบ
7. สปอร์ที่ยังเจริญไม่เต็มที่ (Immature endospore) ติดสีแกรมบวก ส่วนสปอร์ที่เจริญเต็มที่ (Mature endospore) ไม่ติดสีย้อม

แหล่งที่มา

การเตรียมตัวอย่าง (Simple preparation).สืบค้นเมื่อวันที่ 23 สิงหาคม 2560.จาก
      https://www.scribd.com/document/348205778/การยอมสี.pdf

นงลักษณ์ สุวรรณพินิจ, และปรีชา สุวรรณพินิจ. (2554). จุลชีววิทยาทั่วไป. กรุงเทพฯ:
       โรงพิมพ์แห่งจุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย.